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1、載玻片
載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片， 一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。
2、蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光 ，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起到不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本。
3、標本
組織切片或其他標本不能太厚，若太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重疊或雜質掩蓋，影響判斷。
4、封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去 。
5、鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。
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