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胰酶分離提取
點擊次數：677 發布時間：2010-5-24
一、原理與目的
提取制備酶的經典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經此多次提取，zui后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結晶。
胰酶在PH3.0時zui穩定，可在低溫下儲存較長的時間而不失活；低與此PH酶易變性；高于PH5時，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程應在低溫和低PH下進行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理條件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約24000－25000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過程中，酶原N端Lys與Ile之間的 一個肽鏈被斷裂，丟失一個6肽，分子構象發生改變，PI變成10.8。
本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結晶的操作技術。同時為親和層析、免疫學實驗準備實驗樣品。
二、材料與試劑
1．儀器
紫外光分光光度計、恒溫水浴、離心機、組織搗碎機、PH計、顯微鏡、秒表、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。
2．材料：新鮮豬胰臟
3．試劑及溶液配制
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。
0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合后用PH計校正。
三、操作步驟
1．胰蛋白酶原的提取與分離：
（1）稱取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結締組織，在低溫下用絞肉機絞碎胰臟（或用高速組織勻漿機搗碎）加1－2倍體積以預冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提?。ò?g組織相當于1ml體積計算，以此類推）。檢查提取液中PH，若高于PH3.0時應及時用10％乙酸調節，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而后用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘渣一次（時間約為1－2h），合并濾液，此時濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。
（2）鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用4000r/min離心機離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經壓干后稱重，可得約20g胰蛋白酶原粗制品。
（3）胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用于測定，溶液中硫酸銨得含量（約為濾餅重得1/4）。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計算，將已研細的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。
（4）純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調節濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約1000ml，加入已經研細的硫酸銨粉末，使其溶液達40％飽和度（每升濾液加242g硫酸銨）。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉淀。